回到佛罗伦萨一年之后，伽利略去罗马访问。在那里，他进行演说，展示他的望远镜，并参与多种科学和数学问题的争论。尽管他受到教皇和教廷的亲切接见，但对伽利略及其学说的反对也日益增多。许多神学家拒绝接受哥白尼的日心说理论，因为它在地球在上帝创造的秩序中的地位这一问题上与《圣经》和教会的教义相冲突。如今，这些批评者将注意力转移到伽利略身上，他很快就受到警告，说他在讲授和讨论日心说时，应该只把它说成是一种推测。
随后，在1615年，哥白尼的著作《天体运行论》被天主教会列为禁书。于是，一连好几年，伽利略不再就任何天文学话题发表公开评论。然而在1618年，天空中出现了三颗彗星，这使一位耶稣会天文学家宣称，它们的出现证明哥白尼的日心说是错误的。在这种情况下，伽利略再也无法沉默下去了。他发表了《试金者》(Saggiatore)，为哥白尼辩护，并提出自己的主张，即需要有科学探索的自由。
伽利略接受天主教会审判。
天主教会审判伽利略
在这次大胆的举动之后，伽利略在1632 年发表了他最具争议的著作《关于托勒密和哥白尼两大世界体系的对话》(Dialogue Concerning the Two Chief World Systems, Ptolemaic and Copernican)。尽管他得到天主教会的出版许可，但此书出版后不久，就被教会列为禁书。毫不令人意外，该书也使宗教裁判所传唤伽利略去接受关于异端学说罪名的审判。他首先面对的主要问题就是他有没有蔑视教皇，教皇认为伽利略"主张和宣扬哥白尼的学说并为之辩护"。经过五个月的审判，伽利略因主张并相信"有违《圣经》的谬误学说"被判有罪。他受到的处罚是禁止他的《对话》一书出版传播，并判处他入狱。不过，伽利略还有一个选择，那就是放弃他的科学立场。他接受了，并且发誓："我再也不会声称或主张……任何有可能引起进一步怀疑的观点了。"
伽利略余生都在软禁中度过，一开始在锡耶那城(Siena)，后来在阿切特里(Arcetri)。他受到限制，不能有任何外出旅行，一次只能接待几个客人，因此他的生活可以说是寂寞的。1634年，他的爱女去世，这使他的状况恶化。后来在1637年，伽利略失明了。然而，尽管他的健康状况不断恶化，并且教会一直在试图削弱他的影响，但伽利略却名声渐长。在他的晚年，托马斯·霍布斯(Thomas Hobbes)和约翰·弥尔顿(John Milton)等文化名人都来拜访他。伽利略人生的最后几年是在相对隔绝的状态下度过的。他于1642年1月8日在意大利的阿切特里去世。
