1940 年初，抗日战争进入相持阶段后，日寇将进攻重点转向华北，妄图消灭八路军、新四军日益发展的抗日力量。蒋介石也于此时掀起第二次反共高潮。顾祝同执行蒋介石的密令，派人将蒋介石的亲笔信转交上官云相，信中要顾祝同和上官云相及有关军师长注意，行动要特别秘密，迅速、彻底地消灭皖南新四军，不使其漏网。顾祝同对于皖南新四军，早就处心积虑，在新四军军部及该军驻皖南部队周围，部署了4 万余人的兵力进行监视，形成包围态势。
1940 年10 月20 日，顾祝同在长官部的例会上，指定参谋处制订围歼新四军的计划。他强调，执行这个计划要选调战斗力强的部队才管用：选调具有法国装备的四十师，用于第一线；抽调浙东的六十九师到皖南，又把赣东负责指挥对南昌日寇作战的三十二集团军总部调到皖南，并命上官云相统一指挥。他同时命令赶修重庆至上饶之间的长途载波电话线。他声色俱厉地斥责施工负责人："如果不按期完工通话，你负责，要杀你的头。"这样，线路在12 月中旬完工开通，保证了他和蒋介石的密切联系，策划他的罪恶阴谋。顾祝同在遣兵调将的同时，又大肆制造谣言，污蔑新四军无意"北撤"，将要"南下"，"新四军要搞三山计划，南窜黄山、天目山、四明山作抗日根据地"。并三次通令各部加强对皖南新四军的监视和警戒。
在部署围攻新四军的同时，他又公开指定新四军的"北撤"路线。
12 月初，他又接到蒋介石的密令："要一网打尽，生擒叶、项。"12 月31 日，他以长官名义向新四军下达命令："在12 月31 日前，在长江以南的新四军全部开到江北。"在计划接近实施的时候，他又把上官云相秘密召到上饶，亲自交代任务。他特别强调部署要周密，行动要非常谨慎。
1941 年1 月6 日，围攻新四军的战斗打响了。顾祝同严令上官云相传令各部队，务必把新四军包围住。1 月13 日，新四军军长叶挺奉命和顾祝同谈判，顾却下令将叶挺扣押起来。1 月14 日，新四军被围部队终因伤亡过大，弹尽粮绝，9000 名官兵除傅秋涛等人率2000 余人突围外，6000 余人被俘，其余壮烈牺牲。1 月17 日，顾祝同把情况报告国民政府军委会，诡称："国民革命军新编第四军违抗命令，不遵调遣，自上月以来在江南地区集中全军，蓄意扰乱战局，破坏抗日战线，阴谋不轨，已非一日。本月初自泾县潜向南移，竟于4 日明目进攻我前方抗日阵地，危害民族，为虎作伥，丧心病狂，我前方被袭部队，对此不测之变，若不忍痛反击，不仅前线各军之将士无以自卫，而且整个抗日之国策亦被其破坏无余，……新四军全部解散，编遣完毕，该军军长叶挺于当地擒获，副军长项英潜逃不获。"顾祝同为参加这次血腥屠杀新四军的官兵邀功请赏，并奖给第三十二集团军总部、第二十五军和上官云相法币各5 万元。
