1925年冬至1927年春，先后发表《中国社会各阶级的分析》、《湖南农民运动考察报告》等著作，指出农民问题在中国革命中的重要地位和无产阶级领导农民斗争的极端重要性，批评了陈独秀的右倾思想。
国共合作全面破裂后，在1927年8月中共中央紧急会议上，他提出"政权是由枪杆子中取得的"，即以革命武装夺取政权的思想，并被选为中央政治局候补委员。会后，到湖南、江西边界领导秋收起义。接着率起义部队上井冈山，发动土地革命，创立第一个农村革命根据地。1928年4月，同朱德领导的起义部队会师，成立工农革命军(不久改称红军)第四军，他任党代表、前敌委员会书记。以他为主要代表的中国共产党人，从中国的实际出发，在国民党政权统治比较薄弱的农村发展武装斗争，开创了以农村包围城市、最后夺取城市和全国政权的道路。他在《中国的红色政权为什么能够存在?》、《星星之火，可以燎原》等著作中对这个问题从理论上作了阐述。
1930年5月，写《反对本本主义》，提出"没有调查，没有发言权"的著名论断。8月，红军第一方面军成立，任总政治委员。1931年11月7日，中华苏维埃共和国临时政府在江西瑞金成立，被选为主席。1933年1月，被补选为中共中央政治局委员。从1930年底起，同朱德领导红一方面军战胜了国民党军队的多次"围剿"。以王明为代表的"左"倾路线领导集团进入中央革命根据地以后，毛泽东被排斥于党和红军的领导之外，导致红一方面军第五次反"围剿"失败。
